鸡囊胚细胞DMSO细管冷冻保存技术研究

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.010

摘要/Abstract

摘要：

旨在研究高效鸡囊胚细胞（Blastodermal cells，BCs）冷冻保存技术，为利用BCs保存禽类雌性遗传资源以及胚胎干细胞研究奠定基础。采用解冻后二乙酰荧光素 (Fluorescein diacetate，FDA)染色以及培养24 h后细胞贴壁率双重检测BCs活力方法，比较二甲基亚砜（DMSO）不同浓度、不同冷冻与解冻速率等对BCs的冷冻保存效果。结果表明：（1）DMSO不同浓度，20%组解冻后活力最高（0.58），与15%组差异不显著（P>0.05），但与5%、10%和25%组差异极显著（P<0.01）；细胞复苏后贴壁率，20%组最高（30.5%），与15%组差异不显著（P>0.05），与25%组差异显著（P<0.05），与5%和10%组差异极显著（P<0.01）。（2）冷冻速率，使用三步法冷冻，以-1 ℃•min-1的速率降温至-7 ℃，保持10 min，继续降温分别至-15、-35、-55、-75 ℃后，投入液氮中保存，-75 ℃组解冻后活力最高（0.53），但与-35 ℃、-55 ℃组差异不显著（P>0.05）；贴壁率，各组间差异极显著（P<0.01），其中-35 ℃组最高（36.6%）。（3）37 ℃水浴解冻，10 s、1 min、2 min、3 min解冻后，各组间活力差异不显著（P>0.05），其中10 s组最高（0.60），解冻后贴壁率，37 ℃水浴1 min组结果最好（43.9%），与水浴2 min组差异不显著（P>0.05），但与水浴10 s组差异显著（P<0.05），与水浴3 min组差异极显著（P<0.01）。50 ℃水浴5 s、20 s、40 s、1 min解冻，5 s组活力最高（0.70），与20 s组差异显著（P<0.05），与40 s、1 min组差异极显著（P<0.01），解冻后贴壁率，各组间差异均极显著（P<0.01），其中50 ℃水浴5 s 组最高（36.9%），50 ℃水浴 1 min 组最低（5.6%）。综上表明，鸡BCs使用DMSO浓度为20%的冷冻保护剂进行细管冷冻，以-1 ℃•min-1 的速率降温至-7 ℃保持10 min，继续以此速率降温至-35 ℃后，投入液氮保存，37 ℃水浴1～2 min 解冻，BCs 通过FDA染色与体外培养贴壁率双重检测均可获得较好效果。

Abstract:

For developing efficient cryopreservation technology of chicken blastodermal cells (BCs) and storing female poultry genetic resources，the BCs was frozen using dimethyl sulfoxide (DMSO) and straw，and the different DMSO concentration，freezing and thawing rate were compared by calculating the cell viability (CV) using fluorescein diacetate (FDA) and cell adherent rate cultivated for 24 h (CAR).Results showed that：(1) For the concentration of DMSO，the highest CV was in 20% group (0.58) and had no significant difference with group 15% (P>0.05)，but had extremely significant difference with group 5%，10% and 25% (P<0.01).The highest CAR was 30.5% in group 20%，and had no significant difference with group 15% (P>0.05)，but had significant difference with group 25% (P<0.05)，and had extremely significant with group 5%,10% (P<0.01).(2)The 3 steps to freeze BCs was used，and the first step was cooling at a rate of -1 ℃•min-1 to -7 ℃ and kept 10 min，the second step was to continue cooling the temperature at -15,-35,-55 or -75 ℃ respectively，the third step was to plunge the straws into liquid nitrogen.The highest CV was 0.53 of group -75 ℃，and had no significant difference (P>0.05) to group -35 or -55 ℃.The CAR had extremely significant difference within each groups (P<0.01)，and the highest was 36.6% in group -35 ℃.(3) The thawing rate at 37 ℃ water bath for 10 s，1 min，2 min and 3 min，the CV of each groups had no significant difference (P>0.05)，the highest one was 0.60 in 10 s group.The CAR was 43.9% in group 1 min，and it had no significant difference (P>0.05) with group 2 min，had significant difference (P<0.05) with the group 10 s and had extremely significant difference (P<0.01) with group 3 min.The thawing rate of 50 ℃ water bath for 5 s，20 s，40 s or 1 min，the highest CAR was 0.7 in group 5 s，and it had significant difference (P<0.05) with group 20 s，had extremely significant difference (P<0.01) with group 40 s and 1 min.The CAR thawed at 50 ℃ had extremely significant difference within the 4 groups (P<0.01).The highest CAR was 36.9% in group 5 s，and the lowest was 5.6% in group 1 min.In conclusion，the BCs frozen using 20% DMSO and straw，cooling at -1 ℃•min-1 to -7 ℃ for 10 min，continuing to cool at -35 ℃ at the same ratio and plunging into liquid nitrogen，then thawed by 37 ℃ water bath for 1-2 min，could get not only good CV，but also CAR.

中图分类号:

S831.2

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